在蛋白質(zhì)染色方法中，考馬斯亮藍(lán)染色為常用，它克服了氨基黑染色靈敏度不高的限制，又比銀染簡便易操作。可常規(guī)方法需使用劇毒的甲醇和強(qiáng)刺激性的乙酸，難為了一眾小白們。快速蛋白質(zhì)染色劑廠家介紹蛋白質(zhì)的含量測(cè)定有五種經(jīng)典方法：
1、凱式定氮法
原理：蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。蛋白質(zhì)與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，蛋白質(zhì)含量。
2、紫外吸收法
原理：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm附近具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定280nm處的吸光度值可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。
3、雙縮脲法
原理：雙縮脲是兩個(gè)分子脲經(jīng)180°C左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4,形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或通過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。
紫色絡(luò)合物在540nm處有最大吸收，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
4、Folin-酚試劑法
原理：此法是雙縮脲法的發(fā)展，在堿性溶液中銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin試劑)，.產(chǎn)生深藍(lán)色(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物)。在一定的條件下，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比。
5、考馬斯亮藍(lán)法
原理:考馬斯亮藍(lán)G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也有棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm下測(cè)定的吸光度值與蛋白質(zhì)的濃度成正比。
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